支原体是细胞培养中常见的一种污染源。细胞培养中的支原体污染可能来自培养基、血清或实验操作者，会影响细胞生长率、细胞形态、基因表达、细胞代谢和细胞活力。
支原体对细胞的影响，主要从两方面考虑：一方面是对细胞的直接影响，细胞被支原体污染后，增殖缓慢，部分细胞变圆，从瓶壁上脱落，部分细胞虽然表面变化不十分明显，实际上潜伏着多方面的危险；另一方面，支原体可以通过消耗培养基中的精氨酸，抑制细胞DNA、RNA的合成，降低细胞的抵抗力。总的来说，支原体污染对细胞造成的影响是多方面的：包括代谢、免疫或生化特性、生长状况、酶的作用途径、细胞膜的组成、染色体结构、转染效率、以及细胞存活等多方面的改变。
支原体能轻易地通过标准滤膜，同时也能拮抗绝大多数的抗生素。而且，支原体污染细胞后，培养液可不发生混浊，多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解，因此易被忽视。因此，在细胞培养过程中，对支原体的防范、检测和去除非常棘手，也非常重要。
污染实验室培养细胞的支原体主要有八种，通常用于细胞培养的绝大多数抗生素都对其无效。例如青霉素主要作用于细菌细胞壁，但支原体没有细胞壁因此就不受影响。无懈可击的细胞培养技术始终是预防支原体污染的最佳方式，另外及时找出受到支原体污染的培养物也很重要，这样才能在污染扩散前快速采取有效措施。以下就为您介绍几种在细胞培养中检测支原体的常用方法。
1， 分离培养法
分离培养法是支原体检测的金标方法，其检测精确度最高。这种方法是从可疑的细胞培养体系中取样，并接种到最适宜支原体生长的琼脂平板上。如果样本中含有支原体，它们就会在这种琼脂平板上疯狂生长，最终形成明显可见的特征性菌落。分离培养法基本不会出现假阴性结果，因此被誉为支原体检测金标准。不过分离培养法也存在两个弊端，一是检测时间太长，支原体要长出明显克隆至少需要4周时间。二是尽管可以检测绝大多数支原体种类，分离培养法也有力所不及的时候，例如支原体M. hyorhinis尚不能在体外进行培养，因而不能使用这个方法。
如果你实在不想等这么久，或者希望在分离培养法的等待过程中先拿到初步结果，你可以试一试DNA、PCR或酶学检测方法。不过需要注意的是，上述检测方法都不能单独检出所有类型的支原体，而且灵敏度也没有分离培养法高，所以最好结合使用两种方法以获得最可靠的检测结果。
2， 荧光法DNA检测
荧光法DNA检测一般需要几天时间。将可疑样品与指示细胞共同培养，DNA检测所用的指示细胞通常是细胞质区域较大的Vero细胞，如果原样本中含有支原体，那么当细胞DNA被荧光染料（如Hoechst染料）染色时，就可以在指示细胞核周围以及细胞膜周围、培养基中观察到荧光斑点或荧光颗粒。分离培养法用来检测支原体M. hyorhinis菌株并不可靠，而DNA法可以准确的将其检测出来。这个方法的缺点是死亡细胞释放出来的DNA会造成很大干扰，使得判断误差发生率大约在30%左右，因此使用这个方法需要一定的经验。
3， PCR法
PCR法可以检测所有种类的菌株，包括M. hyorhinis菌株。PCR法检测支原体只需几个小时，是最灵敏的支原体检测方法。该方法采用针对支原体DNA的引物用PCR检测可疑样本，其中PCR引物通常针对支原体的16S rRNA基因的保守区域。在凝胶电泳过程中，支原体DNA会显示为特异性条带，以此指示支原体的存在。PCR法可以检测所有种类的支原体，快速，灵敏度最高，缺点是不能区分支原体的死活。而且因为PCR法过于灵敏，在操作过程中容易产生假阳性，所用的器具、枪头、管壁等也都可能因为携带微量的支原体DNA而导致假阳性现象。
4， 酶学检测和ELISA
酶学检测是将可疑样本添加到特定底物中，在这一体系内支原体的酶可以将ADP转化为ATP，随后能利用ATP发光的luciferase酶就可以指示支原体的存在。这个方法的检测速度最快，大概半小时即可完成，死亡的支原体不会造成干扰。缺点是灵敏度比PCR法低，而且需要的检测发光的仪器尚未普及。
ELISA也能用于支原体检测，以ELISA法为基础的支原体检测一般使用针对支原体16S rRNA基因的带标记探针或抗体，来检测培养物中是否含有支原体。这个方法现在已较少使用。
支原体定期检测
支原体污染会使培养细胞慢慢枯萎，因此对培养细胞定期进行支原体检测非常重要。一般来说每1至3个月就应该进行一次例行支原体检测。将定期支原体检测常规化坚持下去，是细胞培养实验室应对支原体污染的关键。对新引进的细胞系应进行检测，防止引入外来的污染源。对于冻存的细胞，在冻存之前或者放入液氮之前进行检测，以免以将含支原体的细胞作为种源保存。
如何预防支原体污染
支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（一些支原体在人体是正常菌群）、培养基的污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。
细胞培养工作中，主要从以下几个方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和器材要保证无菌；在细胞培养基中加入适量的抗生素。最好的预防支原体污染的方法就是严格操作，避免污染。
